使用斜率光谱法进行快速、可重复且更准确的蛋白质浓度检测

Original 瑞普利金 Repligen瑞普利金 2022-12-21

C Technologies, Inc.（Repligen于19年4月收购）的新型SoloVPE（Variable Pathlength Extension，可变光程扩展）是一种用于UV-Vis-NIR光谱法的创新仪器。它可以帮助分析员简单地以另一位维度使用Beer-Lambert法则进行测量，特别是精细的光程控制。SoloVPE快速生成吸光度 vs.光程线性关系图的能力是其光程扫描功能所能实现的独特测量结果之一。通过利用吸光度 vs. 光程关系图的斜率，可快速、简单、精确地测定浓度、消光系数和稀释精度。我们将这种强大的分析技术称为Slope Spectroscopy®（斜率光谱法）。

斜率光谱法介绍

SoloVPE可使用户能够快速、轻松地测量样品在不同光程下的吸光度。在SoloVPE操作中，光程定义为传输光纤的顶端到样品容器内底之间的距离。通过集成的硬件和软件，使光纤在样品内精确地上下移动，从而动态控制光程。SoloVPE软件还包括用于传统和斜率光谱法的实用数据分析工具。

图1和2所示为典型的SoloVPE数据表述。图1所示为同一样品（本例中为肌红蛋白）的光谱图集合。每张光谱图在不同的光程下采集，如Beer-Lambert法则所预测的，随光程的变化，吸光度呈相应比例变化。通常，我们感兴趣的是在特定波长下的吸光度值，即谱图上的波峰或波谷。通过使用SoloVPE软件中的波长截面特征，可生成在所需波长条件下的吸光度 vs.光程关系图，如图2所示。

图1. 光程光谱数据集

图2. 线性回归（线性@400nm）

SoloVPE分析工具可允许用户对波长截面图进行数据回归分析。线性回归分析可提供三个关键参数：斜率和最佳拟合方程的y轴截距以及线性相关系数。线性相关系数表示拟合优度或回归线与实测数据的拟合程度。y轴截距表示回归线与吸光度轴的交点。对回归方程进行处理也可揭示x轴截距或回归线与光程轴的交点。这就是线性回归方程的斜率项，以Abs/mm为计，是Slope Sepctroscopy®潜力和能力的核心。

斜率和Beer法则

尽管回归方程本身可用于预测不能直接测量的特定光程下的吸光度值以及比较不同浓度的溶液，但斜率光谱法的特殊之处在于使用线性回归方程的斜率项快速、简单地进行分析确定。通过对Beer-Lambert法则进行简单的处理，即可揭示斜率的效用。

Beer-Lambert法则可表示为：

A=α·l·c （1）

其中，“A”为吸光度的检测值，“α”为波长依赖性摩尔吸光系数，“l”为光程，“c”为样品浓度。对于斜率光谱法研究，我们将波长“l”移动到方程的左边，上述方程将变为：

A / l=α·c （2）

由吸光度 vs. 光程数据的回归得到的线性方程可写为：

A=m·l + b （3）

其中，“m”为回归线的斜率，“b”为线性方程的y轴截距。已知回归方程中，斜率项的表述为吸光度/光程，即Abs/mm。这种维度的相等性即可允许用公式3中的斜率项（m）直接替换公式2的左侧部分（A/l）。替换后可获得新的方程，我们称为斜率光谱法方程：

m=α·c （4）

如果一个样品的摩尔吸光系数已知，使用斜率光谱法方程，即可简单地计算样品的浓度：

C=m / α（5）

或者已知样品的浓度，也可计算摩尔吸光系数：

α=m / c（6）

解释回归项

如果我们仔细研究回归方程（3）和Beer-Lambert法则（1），我们就会发现，当光程为0时，存在一些差异。根据Beer-Lambert法则，0光程时应为0吸光度。但是，根据回归方程预测，当光程等于0时，虽然吸光度值较小，但不为0。这种吸光度的偏移主要有两个原因：光散射的影响以及接近0值时小的光程偏差。对数据应用常用的散射校正算法，可降低散射对大多数样品偏移的影响。但理解较小的光程偏差则需要更多的解释。

SoloVPE有一种创新的方法用于确定“0”光程位置。但是，不管多小，每个机械系统都有一个公差，SoloVPE也不例外。没有绝对的0位置，所以测量光程会有小的差异。SoloVPE可精确控制光程变化，光程分辨率为5微米（0.005mm）。这很容易通过检验回归的波长截面图上的相关性强度得到验证。R²值接近1确认吸光度值与光程呈比例变化，符合Beer-Lambert法则。实验结果显示，除了具有极强的相关性外，y轴截距也如预期地趋近于0。但是我们怎么把剩余的吸光度偏移量与Beer-Lambert法则结合起来呢？

有两种不同的方法可获得通过原点的回归线。一种是使用强制通过原点进行回归的回归算法。但是，这种方法会改变最佳拟合线的斜率，其在使用回归方程预测超出检测光程范围的吸光度值时，会导致较大的吸光度误差。另一种方法基于x轴截距值为系统光程偏移量的理论，这说明回归数据集可基于x轴截距值对光程进行标准化。将预测方程平移后，可获得更准确的结果。在这种情况下，需要注意的是，将曲线平移使x轴截距为0不会改变回归线的斜率。这就意味着，不管光程准确性如何，使用回归数据集的斜率，可准确预测吸光度值和浓度。

上述可知，斜率光谱法非常稳健，即使存在光程偏差，甚至在最小的光程下，只要当吸光度值 vs. 光程的回归在多个数据点之间（＞5）有强相关性区域，即可快速、准确地确定值。SoloVPE及其快速生成斜率数据的能力，可使用户充分利用斜率光谱技术的优势。

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